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密理博超滤离心管的常见问题与解答

2018-05-25      3082

密理博超滤离心管的常见问题与解答:

一:超滤离心管的膜材质是什么?

密理博超滤离心管的膜材质为默克密理博特有的Ultracel再生纤维素膜,生产工艺严格,截留分子量明确而,蛋白吸附损失zui小。

二:如果要用超滤离心管的方法分离两种蛋白,那么这两个蛋白的大小需要相差多少?

按照经验,建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级(10倍)

三:密理博超滤离心管可以用于病毒浓缩吗?

可以。对于慢病毒推荐Amicon Ultra 100KDa;对于腺病毒推荐Amicon Ultra 50KDa。具体的操作步骤可以参考病毒浓缩纯化试剂盒FTLV00003和 FTAV00003的产品使用说明书。

四:密理博超滤装置是否可以用于高压灭菌?

Amicon Ultra都是采用热封设计,不可以用于高压高温灭菌。

五:超滤离心管可以用酒精消毒灭菌吗?

Amicon Ultra与70%乙醇是兼容的中,但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试,所以无法提供更进一步的参考信息。

六:超滤离心管含不含RNA酶?

不保证超滤离心管不包含RNA酶,建议用0.1%DEPC在37度浸泡2小时,以完全灭活RNA酶;残留的DEPC可以用Milli-Q超纯水洗涤除去。

七:用超滤离心管去除去污剂是有什么需要注意的吗?

去污剂因其独特的性质,当浓度大于临界微团浓度(Critical Micelle Concentration、CMC)时,去污剂分子会聚集形成微团而改变分子构象,这有可能会影响去污剂的去除效果,具体的操作步骤请垂询默克密理博。

八:蛋白在浓缩时出现了沉淀,如何改进?

蛋白浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的zui终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白,建议的方法是1)离心力降为推荐离心力的30%-50% 2)改用截留分子量更大的超滤管(如原本选用10K,此时可以选择30K) 3)在浓缩过程中取出超滤管,用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩。

九:浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因有哪些?

首先,Amicon Ultra超滤管的蛋白zui低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次,如果问题仍然出现,请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因:

1)如果目的样本在过滤液中,那么请排查 :a)是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3) b)使用的离心力是否在限定范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心力。c)离心机zui近是否有校准过?d)是否尝试这个蛋白?如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话,那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性(构象差异)而影响浓缩效果,建议选用上一分子量级别的超滤管(如原本选用30K,此时可以选择10K)。

2)如果目的样本也不在滤过液中,那么:a)蛋白样本起始浓度是否大于25ug/ml?b)用来确定样本浓度的方法是什么?是否可信? c)目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。

十:有时候用超滤离心管连水都离不下来,可能是什么原因?

超滤离心管超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况,请先用0.1N NaOH清洗再离心。zui后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。

十一:说明书推荐在室温下进行离心,考虑到蛋白的稳定性,是否可以在4 摄氏度进行离心?

可以,但是低温会增加蛋白样品的粘性,导致流速减慢,建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。

十二:如何对超滤离心管进行去除内毒素的处理?

提供的超滤离心管是没有经过去内毒素处理的,同时由于内毒素通常以多聚体的形式存在,大小在10-1000KD之间不等,在超滤的过程中是无法去除的。可以实验前通过先用0.5M NaOH预清洗,随后用Milli-Q水/缓冲液清洗的步骤去除大部分内毒素。关于针对Amicon Microcon Centricon尝试过的内毒素去除方案,请垂询默克密理博技术。

十三:用浓缩后的蛋白做下游分析时发现有干扰,可能有哪些原因?

密理博超滤膜含有微量甘油。如果此成分干扰分析,可用缓冲液或Milli-Q水预清洗。如果干扰仍存在,用0.1N NaOH清洗,然后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。

十四:怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附,如何改善?

密理博超滤离心管使用的是再生纤维素膜,这种材质是蛋白吸附zui低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白,它们和膜的非特异吸附可能会增强,对于这种情况,可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理,也可以尝试换成Amicon Ultra0.5或2来进行实验,通过减小膜面积来降低非特异性吸附。